生產(chǎn)商 產(chǎn)品名稱 產(chǎn)品編號 產(chǎn)品規(guī)格 PeproTech 重組人Flt-3 Ligand (Animal Free) AF-300-19 10ug/50ug/100ug/250ug/500ug/1mg PeproTech 重組人IL-7 (Animal Free) AF-200-07 10ug/100ug/250ug/500ug/1mg PeproTech 重組人IL-15 (Animal Free) AF-200-15 10ug/100ug/250ug/500ug/1mg PeproTech 重組人SCF (Animal Free) AF-300-07 10ug/50ug/100ug/250ug/500ug/1mg PeproTech (BioGems) 人CD28 激發(fā)型單抗 (極低內(nèi)毒素) (克?。篊D28.2) 10311-25 100ug/500ug 生產(chǎn)商 產(chǎn)品名稱 產(chǎn)品編號 產(chǎn)品規(guī)格 使用濃度 PeproTech 重組人IFN-γ (Animal Free) AF-300-02 100ug/250ug/500ug/1mg 50ng/ml PeproTech 重組人IL1-α (Animal Free) AF-200-01A 10ug/100ug/250ug/500ug/1mg 0.1ng/ml PeproTech 重組人IL-2 (Animal Free) AF-200-02 50ug/100ug/250ug/500ug/1mg 30ng/ml PeproTech (BioGems) 人CD3 激發(fā)型單抗 (極低內(nèi)毒素) (克隆:OKT-3)05121-25 100ug/500ug 50ng/ml 注:Animal Free 意為無動(dòng)物成分。無動(dòng)物成分的重組細(xì)胞因子在生產(chǎn)過程中不會(huì)有任何動(dòng)物源性物質(zhì),尤其是牛蛋白 的混入,使得zui終獲得的重組人蛋白中不含任何動(dòng)物成分。這樣可避免動(dòng)物病原體(如瘋牛病,克雅氏病等)的污染 及外源蛋白引起的機(jī)體異種排斥和過敏反應(yīng),因此細(xì)胞治療的體外細(xì)胞培養(yǎng)過程中使用無動(dòng)物成分的重組細(xì)胞 因子。 【參考文獻(xiàn)】 [1] Li R, Wang C, et al. Autologous cytokine-induced killer cell immunotherapy in lung cancer: a phase II clinical study. Cancer Immunol Immunother. 2012; 61:2125–2133 CIK 細(xì)胞的制備方法: 【背景】 CIK 是“Cytokine-Induced Killer Cells"的縮寫,中文全稱為“細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞"。 CIK 是單個(gè)核細(xì)胞在CD3 單抗和多種細(xì)胞因子(包括IFN-γ, IL-2 等)的作用下培養(yǎng)獲得的一 群以CD3+CD56+細(xì)胞為主要效應(yīng)細(xì)胞的異質(zhì)細(xì)胞群, 其既具有T 淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活 性,又具有NK 細(xì)胞(自然殺傷細(xì)胞)的非MHC(主要組織相容性抗原)限制性腫瘤殺傷能力。 CIK 細(xì)胞具有殺瘤活性高、殺瘤譜廣,對正常組織毒性低,體外可高度擴(kuò)增等特點(diǎn),是目前 臨床上廣泛使用的過繼性免疫-治療細(xì)胞。 【培養(yǎng)原理】 CIK 培養(yǎng)用細(xì)胞因子和抗體: ?? CD3 激發(fā)型單抗: T 細(xì)胞活化的*信號來自于T 細(xì)胞表面的受體,即T 細(xì)胞抗原受體(T cell antigen receptor, TCR)與APC 提呈的抗原的特異性結(jié)合,也就是T 細(xì)胞對抗原的特異性識別。 TCR 是由2 條不同肽鏈構(gòu)成的異二聚體,在T 細(xì)胞表面,其與CD3 分子通過非共價(jià)鍵 結(jié)合,形成TCR/CD3 復(fù)合體。TCR 識別特異性抗原后會(huì)引起CD3 和T 細(xì)胞表面的輔助 受體CD4 或CD8 分子的胞漿尾部聚集,進(jìn)而激活與胞漿尾部相連的酪-氨酸激酶(Lck, Fyn 和ZAP-70 等),促使CD3 分子胞漿區(qū)的免疫受體酪-氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪-氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪-氨酸(pY)進(jìn)一步 磷酸化下游含酪-氨酸的蛋白,從而引起激酶活化的級聯(lián)反應(yīng)(磷脂酰肌醇途徑或MAP 激 酶途徑等),zui終通過激活轉(zhuǎn)錄因子,使其進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),結(jié)合于調(diào)控T 細(xì)胞增殖和活 化的靶基因(如IL-2 和IFN-γ等),引起基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄,T 細(xì)胞因而由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)為 增殖和活化狀態(tài)。 由上可見,CD3 分子在T 細(xì)胞活化信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著極其關(guān)鍵的作用。CD3 激發(fā) 型單抗與T 細(xì)胞表面CD3 分子特異性結(jié)合后,可引起CD3 分子胞漿區(qū)ITAM 基序中酪 -氨酸的磷酸化,進(jìn)而導(dǎo)致T 細(xì)胞增殖和活化的下游信號的激活,從而使T 細(xì)胞增殖和活 化。也就是說,CD3 激發(fā)型單抗能夠模擬抗原與TCR/CD3 復(fù)合物的識別和激活過程, 從而引起T 細(xì)胞的增殖與活化,因此是CIK 細(xì)胞培養(yǎng)中*的刺激因素。 此外,CD3 激發(fā)型單抗在選用時(shí)一定要注意克隆號。研究表明,僅克隆號為OKT-3 的CD3 激發(fā)型單抗可以刺激所有人的T 細(xì)胞的增殖,而其它克隆號的CD3 激發(fā)型單抗 僅能刺激一部分人的T 細(xì)胞。因此,在進(jìn)行CIK 培養(yǎng)時(shí),選用OKT-3 克隆,以保 證每個(gè)患者的T 細(xì)胞均能被激活。 ?? IL-2 (白細(xì)胞介素-2) IL-2 zui初發(fā)現(xiàn)時(shí)被稱為T 細(xì)胞生長因子(T cell growth factor, TCGF),是引起T 細(xì)胞 增殖zui重要的細(xì)胞因子。IL-2 既是自分泌細(xì)胞因子,也是旁分泌細(xì)胞因子,其通過與T 細(xì)胞表面的IL-2 受體(IL-2R)的特異性結(jié)合而促使T 細(xì)胞活化,并進(jìn)入細(xì)胞分裂狀態(tài)。 此外,IL-2 還可刺激NK 細(xì)胞的生長并增強(qiáng)其殺傷能力。因此CIK 細(xì)胞培養(yǎng)中須添加 IL-2,以促進(jìn)T 細(xì)胞的增殖與活化。 ?? IFN-γ (干擾素-γ) IFN-γ 具有上調(diào)外周血淋巴細(xì)胞表面IL-2R表達(dá)的作用,因此會(huì)增強(qiáng)T細(xì)胞對IL-2促 增殖反應(yīng)的敏感度和強(qiáng)度。在誘導(dǎo)CIK細(xì)胞形成的過程中加入IFN- γ ,可降低IL-2的用量。 研究發(fā)現(xiàn),IFN-γ加入的順序與CIK的細(xì)胞毒活性密切相關(guān)。先加入IFN- γ,培養(yǎng)24后再 加入IL-2,可明顯提高CIK的細(xì)胞毒活性。 ?? IL-1α(白細(xì)胞介素-1α) IL-1α也可以介導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞表面上調(diào)表達(dá)IL-2R。當(dāng)IL-1α與IFN-γ和激發(fā)型 CD3 單抗合用時(shí),可以明顯提高CIK 的細(xì)胞毒作用。 【細(xì)胞制備】 1. 外周血單個(gè)核細(xì)胞的采集 1.1 用血細(xì)胞分離機(jī)采集患者自身的外周血單個(gè)核細(xì)胞50-100mL; 1.2 淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法進(jìn)一步純化單個(gè)核細(xì)胞(PBMC); 1.3 無血清培養(yǎng)液洗滌2 次,獲得純度在90%以上的PBMC。 2. CIK 細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 2.1 將PBMC 按1-2 x 106/ml 的濃度懸浮于無血清培養(yǎng)液中,加入1,000 U/ml 的重組 人IFN-γ,37oC,5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng); 2.2 24h 后加入50ng/ml 的CD3 單克隆抗體和300 U/ml 的重組人IL-2,刺激CIK 細(xì) 胞的生長和增殖; 注:此時(shí)也可同時(shí)加入100 U/ml 的重組人IL-1α。 2.3 每3 天半量換液或擴(kuò)瓶一次,并補(bǔ)加重組人IL-2 300 U/ml; 2.4 在培養(yǎng)的第14d,收獲CIK 細(xì)胞。 2.5 CIK 細(xì)胞質(zhì)控: 2.9.1 臺盼藍(lán)染色檢測:活細(xì)胞應(yīng)在80%以上; 2.9.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CD3、CD8、CD56 等分子的表達(dá):CD3+CD56+細(xì) 胞的比例應(yīng)在20%以上。 2.9.3 細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn):以CIK 細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞,以腫瘤細(xì)胞(可為原代腫瘤細(xì)胞或 腫瘤細(xì)胞株)為靶細(xì)胞,將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按10 : 1(數(shù)目比) 的比例加入 96 孔U 型板中,每孔含靶細(xì)胞1 x 104 個(gè),終體積為200 μl,設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。 培養(yǎng)4h,然后取培養(yǎng)上清,用乳酸脫氫酶(LDH) 試劑盒檢測效應(yīng)細(xì)胞對靶 細(xì)胞的殺傷率。 2.9.4 收獲細(xì)胞前,取少量培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)菌、真菌培養(yǎng),并檢測支原體、衣原體, 及內(nèi)毒素(標(biāo)準(zhǔn):病原學(xué)檢測陰性,內(nèi)毒素<5 Eu)。
|